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TUNEL細胞凋亡檢測具體步驟以及在檢定過程中需要注意的事項
更新時間:2024-08-01   點擊次數:168次
   TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling)細胞凋亡檢測技術是一種靈敏且廣泛應用的方法,用于檢測細胞凋亡過程中DNA斷裂產生的3'-OH末端。本文將詳細介紹TUNEL細胞凋亡檢測的具體步驟以及在檢定過程中需要注意的事項。

  一、TUNEL細胞凋亡檢測具體步驟

  以下步驟基于不同來源的參考信息綜合整理,具體步驟可能因試劑盒品牌或實驗條件的不同而有所差異:

  樣本準備

  組織樣本:將組織樣本進行脫蠟和水化處理,通常包括在二甲苯中浸泡,然后用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)逐步脫水。

  細胞樣本:對于貼壁細胞,先用PBS清洗,然后用4%多聚甲醛固定一定時間(如1小時),再進行細胞通透處理(如使用Triton X-100)。

  細胞通透

  使用蛋白酶K(Proteinase K)處理樣本,通透細胞膜和核膜,確保TUNEL探針能夠進入細胞內。處理時間通常為15-30分鐘,具體取決于樣本類型和厚度。

  TUNEL反應混合液制備

  根據試劑盒說明書,制備TUNEL反應混合液。處理組通常包括TdT酶和熒光素標記的dUTP,而陰性對照組則不含TdT酶。

  TUNEL反應

  將TUNEL反應混合液滴加到樣本上,覆蓋蓋玻片或封口膜,在暗濕盒中避光孵育一定時間(如37℃下60分鐘)。

  清洗與觀察

  使用PBS充分清洗樣本,去除未結合的探針。

  在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞,通常使用特定的激發(fā)波長(如450-500nm)和檢測波長(如515-565nm)。

  (可選)酶聯(lián)顯色反應

  對于某些試劑盒,還可以將熒光信號轉化為比色信號,以便在光學顯微鏡下觀察。這通常涉及使用POD轉換液和DAB底物進行顯色反應。

  復染與封片

  使用蘇木素或甲基綠對樣本進行復染,以襯托組織形態(tài)結構。

  脫水、透明、封片后,在光學顯微鏡下觀察并拍照記錄結果。

  二、檢定過程中需要注意的事項

  樣本處理

  確保樣本脫蠟和水化充分,避免影響后續(xù)步驟的結合反應。

  細胞通透時間要適中,過長可能導致細胞破損,過短則可能影響探針進入細胞。

  試劑配制與使用

  TUNEL反應混合液應在使用前新鮮配制,避免長時間保存導致酶活性降低。

  注意TdT酶對溫度的敏感性,儲存和使用時應避免反復凍融。

  實驗條件控制

  孵育溫度和時間應嚴格按照試劑盒說明書進行,避免影響反應效率。

  實驗過程中應避光操作,以保護熒光探針不受光淬滅。

  清洗步驟

  PBS清洗步驟應充分,避免非特異性染色影響實驗結果。

  清洗次數和時間可根據實際情況進行調整。

  對照設置

  必須設置陽性對照和陰性對照以驗證實驗結果的可靠性。陽性對照通常使用DNase I處理樣本以誘導DNA斷裂;陰性對照則不加TdT酶。

  結果分析

  觀察結果時應注意區(qū)分凋亡細胞與正常細胞以及非特異性染色。

  可結合復染結果和顯微鏡下的形態(tài)學特征進行綜合分析。

  TUNEL細胞凋亡檢測服務涉及多個精細步驟和注意事項。遵循正確的操作步驟和注意檢定過程中的細節(jié)問題對于獲得準確可靠的實驗結果至關重要。

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